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En menos de una década desde su adaptación a una técnica de edición del genoma, se ha utilizado CRISPR-Cas9 en animales de laboratorio y células de todo el mundo, así como en células humanas que ya se están probando en ensayos clínicos para tratar enfermedades. Los usuarios de CRISPR reconocen ampliamente las limitaciones, como las ediciones fuera del objetivo, y los investigadores han estado trabajando para minimizarlas con ajustes en el método.
Agregando a la lista de problemas que pueden ocurrir con CRISPR, un equipo de Los investigadores ahora informan una alta frecuencia de duplicaciones no deseadas al diseñar inserciones genéticas en ratones. De manera preocupante para los científicos, las inserciones no pudieron detectarse mediante el análisis de PCR estándar. Los hallazgos se publicaron la semana pasada (12 de febrero) en Science Advances.
[Este artículo] es otra advertencia sobre el uso de la edición de genes basada en CRISPR-Cas9 para [knock-in ], comenta Ed Bolt, biólogo molecular de la Universidad de Nottingham que no participó en el estudio.
La investigación comenzó cuando el investigador de inmunología Johannes Roth y sus colegas de la Universidad de Mnster en Alemania estaban investigando la función del gen S100A8que codifica una proteína que se une al calcio en las células inmunitarias mediante la ingeniería genética de ratones en los que el gen no se expresó en ciertos tejidos.
Sorprendentemente, encontraron que 30 de casi 50 animales tenían múltiples copias de la construcción insertada, en lugar de una sola.
Para diseñar tales nocauts condicionales, el equipo, que incluía a Boris Skryabin y sus colegas en el instalación central de animales transgénicos y modelos de ingeniería genética en la Universidad de Mnster, fo permitió un enfoque popular. Esto implica reemplazar el gen original con una construcción en la que S100A8 está flanqueado por secuencias específicas que dirigen a una enzima particular para extirpar el gen. Esto conducirá a la desactivación del gen en tejidos particulares una vez que estos ratones se crucen con otros animales transgénicos que expresan la enzima solo en los tejidos de interés.
Los investigadores inyectaron la construcción en ovocitos de ratón fertilizados. , junto con la enzima Cas9 que corta el ADN y su guía CRISPR. En los 34 cachorros editados genéticamente resultantes, realizaron un análisis de PCR estándar y otra forma más especializada de PCR para verificar si la construcción se insertó correctamente. Para su sorpresa, los resultados sugirieron que solo dos de los cachorros parecían tener la inserción correcta, el resto tenía deleciones del gen o tenía genomas inalterados.
Preguntándose por qué la construcción se integró en tan pocos genomas de animales, el El equipo cruzó uno de los ratones con animales de tipo salvaje y estudió la descendencia resultante. Esta vez, utilizaron una combinación de PCR estándar, secuenciación genética y PCR cuantitativa. Este enfoque más completo reveló que, en general, siete ratones tenían la inserción correcta. Para sorpresa aún mayor de los investigadores, el resto de los animales llevaban hasta tres duplicados de la construcción insertada. Esto les llevó a sospechar que tales duplicaciones podrían ser bastante comunes, tanto en los ratones parentales como en su descendencia, y que la forma estándar de PCR que se usa a menudo para analizar tales construcciones las estaba pasando por alto.
El equipo luego examinó el genomas de ratones criados a partir de ratones de tipo salvaje cruzados con animales transgénicos en los que otro gen, IL4, había sido eliminado condicionalmente. Aquí, usaron una forma especializada de PCR que a través de un diseño cuidadoso de cebadores es específicamente adecuada para amplificar secuencias repetitivas.
Sorprendentemente, encontraron que 30 de casi 50 animales tenían múltiples copias de la construcción insertada, en lugar de que uno solo. Por el contrario, cuando repitieron el análisis con PCR estándar, encontraron multiplicaciones en solo cinco animales, lo que confirma la idea de que la PCR estándar no detecta las secuencias duplicadas. Los enfoques regulares de PCR no le permiten identificarlos, explica Skryabin.
La hibridación de transferencia Southern, una técnica muy adecuada para cuantificar el número de copias de secuencias de ADN específicas, pudo confirmar las duplicaciones, tanto en los padres ratones y su descendencia. En general, los investigadores encontraron duplicaciones en nueve de diez grupos de ratones con diferentes inserciones diseñadas. Y en casi 150 crías criadas a partir de cruces de animales de tipo salvaje y transgénicos, el 57 por ciento albergaba múltiples copias.
La mayoría de los investigadores experimentados en el campo probablemente estén al tanto de este problema.
Katharina Boroviak, Instituto Sanger
Sin utilizar técnicas adecuadas para detectar tales duplicaciones, los investigadores pueden no darse cuenta de que las mutaciones no deseadas acechan en los genomas de sus organismos modelo, señalan Skryabin y su colega Timofey Rozhdestvensky, un especialista en ratones transgénicos. Para los investigadores que generan modelos de ratones knockout condicionales, las duplicaciones podrían hacer que las proteínas se eliminen efectivamente en todos los tejidos o producir otros efectos adversos, poniendo en peligro los estudios funcionales de los genes.
Skryabin y Rozhdestvensky dicen que sus hallazgos podrían tener relevancia para la edición de genes en todos los reinos de la vida, desde las plantas hasta las células humanas. Las duplicaciones de alguna manera podrían conducir a peligrosas mutaciones de cambio de marco, dar como resultado proteínas deformadas o causar efectos no deseados graves en los enfoques de terapia génica humana, escriben los dos a The Scientist en un correo electrónico.
The los autores recomiendan que los investigadores que diseñen cualquier inserción genética con CRISPR investiguen si los genomas se editaron correctamente utilizando formas especializadas de análisis de PCR, transferencias Southern o nuevos métodos de secuenciación del genoma completo que son capaces de analizar secuencias repetitivas, para investigar si los genomas se editaron correctamente.
Katharina Boroviak, ingeniera genómica del Instituto Sanger en el Reino Unido que no participó en la nueva investigación, no está sorprendida por los hallazgos. Ella también ha observado duplicaciones de secuencias insertadas en su laboratorio mientras generaba modelos de ratones transgénicos. La mayoría de los investigadores experimentados en el campo probablemente estén al tanto de este problema, agrega.
Los investigadores varían en las técnicas que usan para hacer inserciones de ADN y, por lo tanto, necesitan usar diferentes métodos analíticos para asegurarse de que las ediciones se realicen correctamente. , ella agrega. En su laboratorio, por ejemplo, solemos hacer PCR cuantitativa y un panel completo de PCR reales para asegurarnos de que estamos reproduciendo el ratón correcto y no depender de un solo modo de PCR, dice.
Aunque muchos laboratorios toman las medidas apropiadas de control de calidad, es bueno que alguien haya publicado al respecto, dice ella. [La publicación] hace que los laboratorios más pequeños que realmente no han pensado mucho en ello sean tan conscientes de ello, dice Boroviak. Todo el mundo sigue hablando de lo genial que es CRISPR y de lo maravilloso y fácil que es. Pero si empiezas a profundizar en los detalles. . . puede ver qué es lo que realmente sale mal y con qué frecuencia realmente sale mal, más a menudo de lo que piensa.
Para Bolt, los hallazgos subrayan la necesidad de comprender mejor los procesos de reparación del ADN. Si bien en la superficie CRISPR-Cas9 es una herramienta simple de edición del genoma, se basa en la reparación del ADN para funcionar, un proceso que es terriblemente complejo, dice. Cuando la enzima Cas9 corta el genoma de una célula, activa la maquinaria de reparación genética. En el caso de las inserciones de ingeniería, por ejemplo, se activa el proceso de reparación dirigida por homología, mediante el cual la célula usa una plantilla de ADN para llenar el vacío que ha dejado la enzima Cas9, creando una inserción.
Los investigadores no tienen una buena comprensión de cómo funciona ese proceso, ni cómo podría conducir a duplicaciones no deseadas, dice Bolt, que se especializa en la inestabilidad del genoma. Eso será crucial para entender si los investigadores quieren encontrar formas de evitar el problema y mejorar la precisión de edición de CRISPR-Cas9, algo en lo que Rozhdestvensky y Skryabin ahora están trabajando.
Debemos tener claro que CRISPR-Cas9 es un método realmente poderoso para la eliminación de genes y para comprender la biología, dice Bolt. Pero estábamos muy lejos de entender cómo se puede usar CRISPR-Cas9 para insertar ADN para knock-ins.
BV Skryabin et al., Las inserciones generalizadas de cabeza a cola de plantillas de ADN enmascaran el CRISPR deseado -Eventos de edición del genoma mediados por Cas9, Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aax2941, 2020.
Katarina Zimmer es una periodista independiente residente en Nueva York. Encuéntrala en Twitter @katarinazimmer.